ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀在他莫昔芬誘導基因敲除小鼠模型上的應用

摘要

神經酰胺，尤其是酰基神經酰胺和蛋白結合神經酰胺，對皮膚屏障的形成至關重要。然而，由于參與這些神經酰胺生成的基因敲除會導致小鼠新生致死，其在成年小鼠中的敲除效應一直不明確。

2025年5月，北海道大學藥學部生物化學實驗室的木原章雄研究團隊在《Molecular Biology of the Cell》期刊上發表了題為“Relationship between time-dependent epidermal ceramide composition changes and skin barrier function in adult mice”的研究論文。該研究針對酰基神經酰胺和蛋白結合神經酰胺相關基因敲除導致新生小鼠致死，其在成年小鼠中的作用尚不明確的問題，通過構建他莫昔芬誘導的脂肪酸延長酶Elovl1條件性敲除小鼠模型，探究了成年小鼠表皮中神經酰胺組成的時間依賴性變化與皮膚屏障功能的關聯，同時揭示了皮膚屏障功能受損后的代償反應機制。

實驗材料與儀器

材料

實驗動物：3月齡小鼠。

他莫昔芬、玉米油、dispase分散酶、蛋白K、甲苯胺藍O、染色試劑、氘標記神經酰胺標準品、氯仿、甲醇、乙酸、異丙醇、75%乙醇、RNAlater、TRIzol Reagent、DNA純化試劑盒、NucleoSpin RNA II Kit、PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、KOD FX DNA polymerase。

儀器

Veriti 96-Well Thermal cycler PCR儀、Amersham Imager 600凝膠成像儀、實時熒光定量PCR儀、Illumina NovaSeq 6000測序儀、ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀、顯微鏡、組織破碎儀、離心機、Xevo TQ-XS液相色譜-串聯質譜儀。

ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀

實驗過程

1. 小鼠構建與處理：通過Cre-ERT2小鼠系與Elovl1 flox小鼠系雜交獲得Elovl1 cKO小鼠和對照小鼠，均飼養在特定無病原體環境中（室溫23±1°C、濕度50±10%、12小時光照-黑暗周期），自由攝食飲水。對3月齡Elovl1 cKO小鼠進行腹腔注射他莫昔芬，間隔1天，共5次，誘導Elovl1基因敲除。

2. 基因組PCR檢測：在他莫昔芬給藥后0、5、10、15、30天，采集小鼠背部剃毛皮膚，經dispase 4°C孵育24小時分離表皮和真皮；取3.0mg干燥表皮，用裂解緩沖液和蛋白K處理后提取基因組DNA，通過PCR擴增Elovl1相關片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測并定量，驗證基因敲除效率。

3. 皮膚屏障功能檢測：

TEWL測量：在他莫昔芬給藥后0、5、10、15、20、25、30天，小鼠經異氟醚麻醉、剃毛后，使用ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀在背部測量，每只小鼠測量2次取平均值。

甲苯胺藍染色：給藥30天后，頸椎脫臼處死小鼠，剃毛后經甲醇處理、PBS洗滌，用0.1%甲苯胺藍O溶液4°C染色24小時；沖洗后將皮膚切成1cm2小塊，經水孵育后測量630nm處吸光度，定量透皮的甲苯胺藍量。

4. 表皮形態觀察：在他莫昔芬給藥后0、10、30天，采集小鼠背部皮膚，制作切片并進行染色，顯微鏡下觀察表皮形態，測量基底層至顆粒層的厚度，記錄脂質片層和角質透明顆粒的變化。

5. 神經酰胺組成檢測：在他莫昔芬給藥后0、5、10、15、30天，分離小鼠表皮，加入氯仿/甲醇混合液和鋯珠，經組織破碎儀處理后提取脂質；通過LC-MS/MS分析神經酰胺的種類和數量，利用氘標記標準品進行定量，計算脂肪酸鏈加權平均長度。

6. 基因表達檢測：

RNA測序：給藥30天后采集小鼠背部皮膚，經破碎、TRIzol提取總RNA并純化；構建測序文庫后在Illumina NovaSeq 6000上進行150bp雙端測序，經質量控制、修剪和比對后，計算轉錄本每百萬讀數值。

實時定量RT-PCR：將純化的總RNA反轉錄為cDNA，使用特異性引物和KOD SYBR qPCR Mix，在實時熒光定量PCR儀上檢測目標基因的mRNA表達水平，以Hprt1為內參基因進行標準化。

7. 統計分析：數據以平均值±標準差表示，采用Welch氏t檢驗、Dunnett檢驗和Tukey檢驗進行統計分析，p<0.05為差異具有統計學意義，通過SPSS進行異常值檢驗。

實驗結論

1. 酰基神經酰胺和蛋白結合神經酰胺對維持成年小鼠皮膚屏障功能至關重要，盡管其并非成年小鼠生存所必需；而相關基因敲除導致的這兩種神經酰胺缺乏在新生小鼠中會引發致死性皮膚屏障缺陷。

2. Elovl1基因敲除后，成年小鼠表皮神經酰胺呈現時間依賴性變化：酰基神經酰胺從第5天開始下降，蛋白結合神經酰胺從第10天開始減少，總神經酰胺從第15天開始降低，NS神經酰胺的減少最晚，而NP神經酰胺從第15天開始增加。

3. Elovl1基因敲除導致非酰基游離神經酰胺的脂肪酸鏈縮短，且不同類別神經酰胺受影響的物種和變化時程存在差異；同時引發表皮形態改變，第10天即出現脂質片層形成受損和表皮增厚，第15天出現部分脫毛和毛發褐變。

4. 皮膚屏障功能受損與神經酰胺變化相關：第15天起TEWL明顯升高，且與酰基神經酰胺和蛋白結合神經酰胺均降至對照組約30%的時間點一致；耳朵部位因皮脂腺數量少、皮脂分泌不足，皮膚屏障功能本身弱于背部和腹部。

5. 皮膚屏障功能降低后會啟動代償反應：包括Elovl3、Degs2等與脂質代謝相關基因表達上調，NP神經酰胺含量增加，以及角質形成細胞增殖和分化相關基因表達改變等。