超全熒光定量PCR應用常見問題匯總！

20世界90年代由美國Applied Biosystems公司推出實時熒光定量PCR技術（Real-time qPCR），其基本原理是在常規PCR基礎上添加熒光染料或熒光染料探針，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程。熒光定量PCR最大的優勢可以對初始模板進行定量，目前已廣泛應用于生命科學、醫學研究等領域。

實驗結果一旦遇到沒有Ct值情況，就要在第一時間排查是否有以下問題：

在相對定量中，Ct值一般控制在15~25之間比較好，如果在絕對定量中，對低拷貝數的樣品，Ct值會增大，但是一般不宜超過40循環，否則定量不準確。因此，判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況，需要根據具體實驗設計和目的進行。

如果遇到標準曲線線性關系不佳R²<0.9）的情況，那么很有可能是以下環節存在問題：

（1）標準品稀釋或者加樣存在誤差，吸樣不準，使得標準品不呈梯度；

（2）標準品出現降解。應避免標準品反復凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，不要反復凍融，現配現用；

（3）引物或探針不佳。重新設計更好更穩定的引物或探針；

（4）模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據現有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量不超過500ng，以50~500ng為宜。

如果陰性對照擴增有信號，首先排查各操作環節是否有不當，造成交叉污染：

（1）引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

（2）引物濃度不佳。適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

（3）鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。

（4）模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異性擴增。

（5）交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環境進行處理，或者更換新的環境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。

如果熔解曲線峰不特異，那么很有可能是以下環節存在問題：

（1）引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現，這是最主要因素；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時，適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；

（2）離子濃度不合適。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優化能力不適合，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結果；

（3）模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異性擴增。

該情況適用于針對所有的基因，特別是內參基因仍無法獲得較好的擴增信號時，應考慮如下情況：

（1）反應試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；

（2）反應條件不夠優化。可適當降低退火溫度或改為三步擴增法，適當延長變性退火時間；

（3）反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入的，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系，減少抑制物的影響。

如果遇到擴增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，那么很有可能是以下環節存在問題：

參考文獻：

Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits （EUROGENTEC）